10.1 METODOS DE PURIFICACION Y ANALISIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS.

Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas del delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la sangre.

El ADN en solución es una mezcla de ADN mitocondrial, nuclear eucariota y viral/bacteriano si estuvieran presentes en la muestra virus/bacterias.

El sistema de valoración de la concentración de ADN será función de cuales han sido los tratamientos y, por tanto, del grado de pureza del ADN obtenido. Pueden emplearse desde métodos altamente sensibles y exactos como la espectrofotometría y fluorometría, hasta métodos aproximativos, tales como la comparación del grado de fluorescencia respecto a un control de concentración conocida.

Una vez conocida la concentración del ADN, éste será utilizado básicamente con el propósito de amplificar determinadas secuencias del mismo mediante PCR.

Los pasos necesarios para una correcta extracción y purificación del ADN mediante un procedimiento químico son:

v  Lisis de las células o virus. Las sales caotrópicas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromoléculas como las proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo su desnaturalización. La adición de un detergente como el SOS es necesaria a menudo para eliminar las membranas.

v  Degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición de una proteasa. La fracción proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sódico.

v  Purificación. Consta de 3 fases: Precipitación del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol frío o isopropanol i recuperar mediante una centrifugación. El alcohol del sobrenadante se llevará las sales añadidas previamente.

Bibliografía:

www.microbial-systems.com/web/docs/Newsletter_Microbial_03.pdf

http://genmolecular.wordpress.com/tecnicas-de-biologia-molecular/

10.2 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

         LA HIBRIDACION

·         Es un proceso de unión de dos hebras complementarias de ácidos nucleicos pero cuyo origen es distinto. Una de ellas será el ácido nucleico diana y la otra será la sonda empleada para localizar ese ácido nucleico diana.

                           TECNICAS:

HIBRIDACIÓN IN SITU CON FILTRO: Este método tampoco precisa de extracción de ADN y analiza muestras obtenidas por raspado o con torunda o cepillo. Las células se aplican directamente sobre un filtro el cual se trata con sustancias alcalinas para la lisis celular y la desnaturalización del ADN.

HIBRIDACIÓN SOUTHERN BLOT: Necesita de la extracción del ADN de la muestra con fenol/cloroformo y de la eliminación de ARN y proteinas de la misma por digestión enzimática. Con la aplicación de endonucleasas de restricción-la enzima Pst I es la mas utilizada, pues corta los genomas de HPVs en fragmentos de diferentes tamaños ofreciendo un patrón característico en el gel de agarosa-el ADN se rompe, realizándose una separación electroforética de los fragmentos en gel de agarosa los cuales pueden ser visualizados con bromuro de etidio

NORTHERN: El segundo método, tipo [[Northern blot] o northern blot, se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda; a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar ADN, el método northern sirve para identificar ARN.

El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las cadenas de ARN en estado desnaturalizado. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern. El método del northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de expresión génica; para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero en qué condiciones, en qué tejidos o tipos celulares.

PCR: La PCR, o Reacción en Cadena de la Polimerasa, utiliza un paso de hibridación de oligonucleótidos para completar el proceso. Entre el paso de desnaturalización de las hebras del ADN y antes del paso de extensión del cebador hay un paso de unión de los cebadores a la hebra de secuencia complementaria mediante una hibridación de ADN. Es el paso de menor temperatura de la PCR y el que marca la especificidad de la reacción.

Bibliografía:

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Hibridación